Rantai Kloning Tikus Berakhir Setelah 58 Generasi akibat Akumulasi Perubahan DNA Berbahaya

Eksperimen 20 Tahun Mencapai Batasnya

Setelah 30.947 upaya transfer inti dan menghasilkan lebih dari 1.200 tikus yang dikloning secara berurutan dari satu betina, tim peneliti Jepang mengakhiri eksperimen yang berlangsung sekitar 20 tahun. Kelima tikus yang lahir pada generasi ke-58 semuanya mati keesokan harinya, mengakhiri rangkaian yang dahulu diperkirakan para peneliti dapat berlanjut tanpa batas.

Eksperimen yang dilakukan pada 2005 hingga 2025 itu menemukan bahwa kloning berulang menyebabkan perubahan berbahaya pada DNA menumpuk. Keberhasilan kelahiran awalnya meningkat, dari sekitar 7% pada generasi pertama menjadi 15,5% pada generasi ke-26. Angkanya mulai turun pada generasi ke-27 dan akhirnya mencapai 0,6%, atau sekitar enam kelahiran untuk setiap 1.000 embrio hasil kloning yang ditransfer ke induk pengganti.

Temuan ini dimuat dalam Limitations of serial cloning, yang diterbitkan di Nature Communications. Universitas Yamanashi menyebut Associate Professor Sayaka Wakayama dan Profesor Teruhiko Wakayama, direktur Pusat Bioteknologi Lanjut universitas tersebut, sebagai peneliti dalam pengumuman riset.

Hasil yang paling mengungkap adalah kontras antara penampilan dan kemampuan reproduksi. Banyak tikus dalam rangkaian tersebut tampak sehat dan hidup sekitar dua tahun, tetapi generasi-generasi berikutnya semakin sulit berkembang biak, baik melalui kloning maupun perkawinan biasa.

Teruhiko Wakayama, pelopor kloning tikus di Universitas Yamanashi, menjelaskan pertanyaan di balik eksperimen tersebut dengan perbandingan yang mudah dipahami:

Menyalin gambar dengan mesin fotokopi menghasilkan kualitas gambar yang sedikit lebih rendah. Menyalin salinan itu sekali lagi membuat kualitasnya semakin buruk,

Pada tikus-tikus tersebut, perubahan mencakup huruf-huruf DNA individual maupun bagian kromosom yang jauh lebih besar. Penelitian ini mengaitkan akumulasi perubahan tersebut dengan kemerosotan keberhasilan kelahiran pada akhirnya.

Bagaimana Peneliti Mengkloning Hasil Kloning

Tim menggunakan transfer inti sel somatik. Sel somatik adalah sel tubuh, bukan sel telur atau sperma. Peneliti mengambil inti sel, yang memuat sebagian besar instruksi genetik sel, lalu memindahkannya ke sel telur yang belum dibuahi dan inti selnya telah diambil.

Sel telur itu kemudian harus mengatur ulang instruksi tersebut agar inti dari sel tubuh dewasa dapat mengarahkan perkembangan embrio. Peneliti memindahkan embrio yang terbentuk ke induk pengganti dan menggunakan sel dari klon yang bertahan hidup untuk menghasilkan generasi berikutnya.

Sel donor berasal dari sel kumulus, yang mengelilingi dan menopang sel telur. Donor awal adalah tikus betina berbulu agouti, yakni warna bulu yang terbentuk dari pita pigmen di sepanjang tiap helai rambut. Semua tikus hasil kloning berjenis kelamin betina dan memiliki warna bulu tersebut.

Peneliti menghasilkan sekitar tiga hingga empat generasi per tahun. Alih-alih membuat setiap tikus langsung dari sel donor awal yang disimpan, mereka meneruskan garis keturunan berulang kali melalui hewan hasil kloning yang baru. Rancangan ini memungkinkan mereka menelusuri perubahan yang diwariskan dari satu generasi ke generasi berikutnya.

Mengapa Hasil Awal Tampak Menjanjikan

Pengumuman RIKEN pada Maret 2013 menggambarkan eksperimen yang masih menunjukkan perkembangan menggembirakan. Saat makalah diajukan, tim telah menghasilkan 581 tikus selama 25 generasi; jumlahnya mencapai 598 tikus selama 26 generasi pada saat pengumuman tersebut.

Peneliti menggunakan trichostatin A atau TSA, obat yang membantu inti sel hasil transfer mengatur ulang aktivitas gennya. Upaya sebelumnya untuk melakukan kloning tikus berulang kali hanya mencapai sekitar enam generasi. Dengan TSA dan kondisi eksperimen yang lebih baik, keberhasilan kelahiran meningkat, bukannya terus menurun.

Pengukuran kesehatan, kesuburan, masa hidup, dan ujung kromosom juga tampak meyakinkan pada tahap itu. Karena itu, peneliti meyakini proses tersebut mungkin dapat berlanjut tanpa batas. Melanjutkan pengamatan terhadap garis keturunan yang sama selama satu dekade berikutnya mengungkap masalah yang belum terlihat dalam 25 generasi pertama.

Tahapan utama menunjukkan bagaimana kesimpulan itu berubah:

• 2005: Kloning berurutan dimulai. Makalah akhir menyebut eksperimen dimulai pada Januari, sedangkan laporan RIKEN pada 2013 menyebut akhir tahun.
• 8 Maret 2013: RIKEN mengumumkan 598 tikus selama 26 generasi, dengan keberhasilan kelahiran mencapai sekitar 15%.
• Mulai generasi ke-27: Keberhasilan kelahiran mulai menurun secara berkelanjutan, meski angkanya bervariasi antargenerasi.
• 2025: Eksperimen berakhir pada generasi ke-58 setelah kelima tikus yang lahir pada generasi itu mati keesokan harinya.

Apa yang Berubah di Dalam DNA?

Pengurutan genom menemukan sekitar 3.700 varian nukleotida tunggal dan 80 insersi atau delesi kecil antara generasi pertama dan ke-57. Varian nukleotida tunggal atau SNV adalah perubahan pada satu huruf dalam urutan DNA. Insersi atau delesi menambahkan atau menghapus bagian kecil dari urutan tersebut.

Makalah itu menghitung rata-rata 69,4 SNV dan 1,4 insersi atau delesi kecil per generasi. Banyak perubahan DNA hanya berdampak kecil, tetapi sebagian mengganggu instruksi yang diperlukan untuk perkembangan atau reproduksi normal.

Sebagai perbandingan, peneliti memeriksa dua galur tikus yang dipertahankan selama 60 generasi melalui perkawinan antarsaudara kandung dalam kurun sekitar 20 tahun. Galur-galur itu mengakumulasi rata-rata 22,3 SNV per generasi. Dengan demikian, laju pada garis keturunan hasil kloning sekitar 3,1 kali lebih tinggi, berdasarkan perbandingan 69,4 dengan 22,3.

Proporsi varian kecil yang diperkirakan mengganggu atau mengubah protein juga meningkat. Angkanya naik dari 0,52% pada perubahan yang muncul antara generasi pertama dan ke-23 menjadi 1,19% pada perubahan antara generasi ke-23 dan ke-57.

Peneliti juga merekonstruksi silsilah tikus berdasarkan DNA mereka. Hasilnya cocok dengan catatan garis keturunan eksperimen, yang memastikan bahwa tikus-tikus tersebut tetap merupakan keturunan donor awal sepanjang eksperimen.

Perubahan Kromosom yang Lebih Besar Menambah Beban

Tikus-tikus itu mengalami lebih dari sekadar perubahan pada huruf DNA individual. Pengurutan mengidentifikasi sekitar 80 hingga 84 varian struktural baru, yaitu perubahan yang lebih besar pada susunan atau jumlah DNA, antara generasi pertama dan ke-57.

Sebanyak 16 varian besar melibatkan bagian yang mencakup sedikitnya 40.000 huruf DNA. Perubahan yang ditemukan mencakup hilangnya satu kromosom X, perubahan besar pada kromosom empat, serta pertukaran materi antara kromosom tujuh dan sembilan.

Pada generasi ke-57, peneliti memperkirakan sekitar 30 mutasi menyebabkan hilangnya fungsi gen dan sekitar 50 mengubah instruksi protein yang dikodekan oleh gen, bahkan sebelum memperhitungkan hilangnya satu kromosom X. Dua delesi besar juga memengaruhi wilayah yang sama dan menghilangkan fungsi kedua salinan gen bernama Csmd1.

Para penulis mengaitkan penurunan angka kelahiran dengan akumulasi mutasi. Menurut penjelasan mereka, perubahan merusak tambahan menjelang akhir eksperimen membuat genom yang sudah mengalami banyak perubahan itu melampaui batas yang dapat ditoleransi oleh tikus yang sedang berkembang.

Asal-usul laju mutasi yang lebih tinggi itu belum diketahui. Transfer berulang inti sel tubuh mungkin berkontribusi, dan sel tubuh dapat mengakumulasi mutasi selama hidup seekor hewan. Tidak adanya reproduksi seksual biasa juga mengubah cara mutasi diwariskan antargenerasi.

Mengapa Pengaturan Ulang Aktivitas Gen Saja Tidak Cukup

Kloning membutuhkan lebih dari sekadar memindahkan DNA ke dalam sel telur. Sel telur juga harus mengatur ulang penanda kimia yang membantu menentukan gen mana yang aktif. Penanda ini disebut epigenetik karena mengatur penggunaan DNA tanpa mengubah urutannya.

Peneliti menduga kegagalan dalam proses pengaturan ulang ini mungkin bertambah buruk pada setiap putaran kloning. Namun, pengukuran mereka justru menunjukkan bahwa akumulasi mutasi DNA merupakan penjelasan utama bagi penurunan pada tahap akhir.

Tikus hasil kloning memiliki plasenta yang membesar, ciri yang telah diketahui pada kloning tikus. Sepanjang eksperimen, berat plasenta rata-rata sekitar 0,30 gram, dibandingkan dengan 0,11 gram pada kelompok kontrol yang dihasilkan melalui fertilisasi in vitro. Namun, beratnya tidak terus meningkat pada generasi-generasi berikutnya.

Pengujian beberapa penanda epigenetik pada embrio awal juga menunjukkan pola yang secara umum serupa pada klon yang baru dihasilkan dan klon generasi ke-51. TSA tetap membantu: keberhasilan kelahiran generasi ke-51 mencapai 5,4% dengan pengobatan, dibandingkan 1,6% tanpa pengobatan.

Telomer, urutan DNA pelindung di ujung kromosom, menjadi kemungkinan penjelasan lainnya. Analisis pengurutan pada tahap selanjutnya hanya menemukan sedikit bukti pemendekan yang berarti pada generasi-generasi yang diteliti. Secara keseluruhan, hasil pengujian mengarahkan perhatian pada beban perubahan yang terus bertambah dalam urutan DNA dan struktur kromosom.

Tikus yang Tampak Sehat Menghasilkan Lebih Sedikit Anak

Perkawinan biasa memperlihatkan penurunan kemampuan reproduksi yang sulit diketahui dari penampilan tikus-tikus tersebut. Tikus betina generasi ke-20 menghasilkan rata-rata 9,9 anak per kelahiran saat dikawinkan dengan tikus jantan normal, hampir sama dengan rata-rata 10,3 pada kelompok kontrol.

Rata-rata jumlah anak per kelahiran kemudian turun menjadi 2,8 pada generasi ke-50 dan 2,2 pada generasi ke-55. Angka terakhir itu sekitar 79% lebih rendah daripada rata-rata kelompok kontrol, berdasarkan perbandingan 2,2 dengan 10,3 anak.

Jumlah sel telur yang diambil setelah stimulasi hormon tidak menurun seiring bertambahnya generasi hasil kloning. Karena itu, peneliti mengamati apa yang terjadi pada sel telur setelah aktivasi atau pembuahan.

Ketika sel telur dibuahi di laboratorium dengan sperma dari tikus jantan normal, 97,6% embrio kontrol mencapai tahap blastokista, yakni tahap awal sebelum implantasi. Proporsinya mencapai 39,7% pada sel telur dari klon generasi ke-25 dan 20,3% pada sel telur dari klon generasi ke-53.

Eksperimen menggunakan sel telur generasi ke-56 menemukan masalah pada inti sel maupun sitoplasma, yaitu materi yang mengelilinginya. Penggantian salah satu komponen dengan komponen pasangannya dari sel telur kontrol tetap menghasilkan tingkat perkembangan yang sangat rendah. Kedua bagian sel telur itu tampaknya mengalami gangguan.

Reproduksi Seksual Memulihkan Sebagian Kesuburan

Beberapa keturunan klon generasi akhir bertahan hidup dan bereproduksi dengan lebih baik. Meski tikus betina hasil kloning generasi ke-55 rata-rata menghasilkan 2,2 anak per kelahiran, keturunan mereka kemudian menghasilkan rata-rata 7,0 anak per kelahiran, lebih dari tiga kali lipat.

Plasenta pada cucu-cucu tikus tersebut juga ukurannya mendekati plasenta embrio hasil pembuahan, bukan plasenta membesar yang lazim ditemukan pada tikus hasil kloning.

Reproduksi seksual mengacak kembali materi genetik saat sel telur dan sperma terbentuk, lalu menggabungkannya dengan DNA dari induk lain saat pembuahan. Salinan gen yang berfungsi dari salah satu induk terkadang dapat mengimbangi salinan yang rusak dari induk lainnya. Embrio dengan masalah genetik parah mungkin berhenti berkembang, sementara embrio dengan kombinasi yang dapat berfungsi akan bertahan hidup.

Keturunannya tetap mewarisi mutasi dari tikus betina hasil kloning. Pengurutan genom menemukan varian pada anak maupun cucu, termasuk pertukaran antara kromosom tujuh dan sembilan. Peneliti menduga kedua kromosom yang berubah itu diwariskan bersama sehingga pertukaran tersebut tetap seimbang.

Peningkatan jumlah anak per kelahiran ini menunjukkan pemulihan sebagian kemampuan reproduksi melalui reproduksi seksual. Keturunannya dapat berkembang biak dengan lebih baik sembari tetap membawa sebagian perubahan genetik yang terakumulasi selama proses kloning.

Arti Temuan Ini bagi Konservasi dan Peternakan

Kloning menarik perhatian pegiat konservasi karena sel yang disimpan dapat melestarikan materi genetik hewan yang sudah mati atau tidak dapat berkembang biak. Di bidang peternakan, kloning menawarkan cara untuk memperbanyak hewan dengan sifat yang bernilai. Eksperimen ini menunjukkan mengapa penggunaan tersebut perlu memperhatikan kondisi DNA donor dan kesehatan reproduksi keturunannya.

Temuan ini berkaitan dengan kloning berulang melalui rangkaian panjang donor yang berganti-ganti. Lima puluh delapan generasi merupakan titik akhir garis keturunan tikus ini dalam kondisi eksperimen tersebut; jumlah generasi yang mungkin dicapai pada garis keturunan lain atau spesies mamalia lain belum diketahui.

Katarzyna Malin, ahli endokrinologi perkembangan di Universitas California, Davis, yang tidak terlibat dalam penelitian ini, mengatakan bahwa temuan tersebut mendukung upaya konservasi yang mencegah spesies sampai pada kondisi krisis, alih-alih mengandalkan kloning untuk menyelamatkannya setelah krisis terjadi.

Ben Novak dari organisasi konservasi Revive & Restore menyoroti relevansi mutasi yang menumpuk di jaringan tubuh selama hidup hewan. Sel donor membawa riwayat perubahan DNA-nya sendiri, dan hal itu penting ketika sel tersebut menjadi titik awal bagi hewan lain.

Studi ini menyatukan dua pelajaran praktis. Kloning dapat mempertahankan akses terhadap materi genetik seekor hewan selama banyak generasi, tetapi kesehatan keturunannya juga bergantung pada apa yang terjadi pada DNA tersebut seiring waktu. Dalam eksperimen ini, perkawinan biasa memungkinkan sebagian keturunan memulihkan kesuburan setelah rangkaian kloning mendekati akhirnya.

Poin Utama

• Peneliti melakukan 30.947 upaya transfer inti dan menghasilkan lebih dari 1.200 tikus dari satu betina awal melalui kloning berurutan.
• Keberhasilan kelahiran mencapai puncak 15,5% pada generasi ke-26, lalu turun menjadi 0,6% menjelang akhir eksperimen.
• Kelima tikus generasi ke-58 mati sehari setelah lahir, mengakhiri rangkaian tersebut pada 2025.
• Garis keturunan hasil kloning mengakumulasi sekitar tiga kali lebih banyak perubahan pada satu huruf DNA per generasi dibandingkan galur pembanding yang dipertahankan melalui perkawinan antarsaudara kandung.
• Mutasi DNA berbahaya dan perubahan kromosom besar menumpuk, sementara kelainan epigenetik yang diukur tidak memburuk secara progresif.
• Reproduksi seksual meningkatkan kesuburan sebagian keturunan, meski mutasi yang diwariskan tetap ada.